1413-cü ildə Antonio Barbaro və Françeskina Barbaronu ailəsində doğulmuşdu. Məşhur üzvü idi. 1434-cü ildə Nona Duodo ilə evlənmiş, 3 qızı və Ciovanni adlı oğlu olmuşdur.

1436-cı ildə Venesiyanı tərk edərək Azov dənizi sahilindəki Genuya koloniyası olan şəhərinə ticarət məqsədilə gəlir və 1452-ci ilədək burada qalır. 1437-ci ildə Alanların son hökmdarının qəbrini kəşfə çıxan və bu kurqandan xəzinə əldə etmə cəhdləri uğursuz oldu. Daha sonra bu kurqan rus arxeoloq Aleksandr Miller tərəfindən tapıldı və əslində mətbəx olduğu üzə çıxdı. Tanada olduğu müddətdə Barbaro tatar dilini və şərq adətlərini öyrənir. 1438-ci ildə Böyük Orda xanı xanın hücumu ərəfəsində ona diplomat olaraq göndərildi. Barbaro, Starıy Krım, , Balaklava, Feodosiya, Kazan və Nijni Novqorod şəhərlərini də bu ərəfədə ziyarət etdi.

1446-cı ildə o Venesiyaya çağrıldı və seçildi. Venesiyaya qayıtdıqdan sonra, 1448-ci ildə və koloniyalarını idarə etdi və sonrakı il istefa verdi. 1452-ci ildə bir daha Venesiyaya qayıtdı. 1460-cı ildə Tana məclisinə seçilsə də bundan imtina etdi. 1463-cü ildə Albaniyanın təyin olundu.Skanderbeqlə birlikdə Osmanlıya qarşı döyüşdü. Skanderbeqin ölümündən sonra Venesiyaya qayıtdı. 1472-ci ildə seçkilərdə iştirak etdi.

Osmanlı-Venesiya müharibəsinin başlayanda Venesiya Ağqoyunlu dövlətində Lazzaro Kverinini səfir olaraq göndərsə də kömək ala bilməmişdi. 1471-ci ildə Ağqoyunlu səfiri Murad, Kverini ilə birlikdə Venesiyaya getmiş, yeni səfarət planları üçün danışıqlara qoşulmuşdu. Bu dəfə Ağqoyunluya səfir olaraq seçilmişdi. Bunda Katerino Zenonun həyat yoldaşının Uzun Həsənin həyat yoldaşının bacısı qızı olması da önəmli faktor olmuşdu. Bu səfarətə Barbaro da qoşulmuşdu. İosafat Barbaro türkcə və azca farsca bildiyi üçün önəmli hesab olunurdu. Səfarətlə birlikdə Ağqoyunlu ordusu üçün çoxlu miqdarda odlu silah və barıt da göndərildi. Barbaro Kiprə çatanda Uzun Həsənin Ərzurum yaxınlığında osmanlılara məğlub olduğu xəbərini alır.

1453-cü ildə Ambrozio Kontarini də səfarətə qoşuldu. Səfarət bundan sonra Qahirə-Adana-Urfa marşrutu üzrə hərəkət etdi. 1474-cü ilin fevralında Kiprdən çıxan səfarət özünü müsəlman zəvvarlar qılığına salmışdı. Daha sonra Təbrizə getmək üçün dağlıq ərazidən keçərkən səfarət kürdlərin hücumuna məruz qalır. Barbaro yaralı olaraq xilas ola bilsə də Ağqoyunlu səfiri və Barbaronun katibi öldürülmüşdü. Səfarət 14 aprel 1474-cü ildə Təbrizə çatdı.

O, hətta Uzun Həsəni Gürcüstan səfərində müşayiət edir, lakin şahı Osmanlıya qarşı müharibəyə razı sala bilmir. Uğurlu Məhəmmədin üsyanına şahidlik etmişdir. O, Təbriz, Sultaniyyə, Kaşan, Qum, Yəzd, Şiraz, Bağdad və Persepolisdə olmuşdur. Pasarqadı ziyarət edən ilk avropalıdır. 1474-cü ildə Uzun Həsən Kontarinini Venesiyaya göndərdi lakin İosafatı saxladı.

1478-ci ildə Uzun Həsənin ölümündən sonra Venesiyaya qayıtdı. Ona bir erməni bələdçinin kömək etdiyini yazır. 1479-cu ildə Venesiyaya çatdı və təcrübəsi barədə hökumətə məruzə verdi. 1482-1485-ci illərdə Roviqo və proveditoru idi. 1494-cü ildə vəfat etmiş, kilsəsində basdırılmışdır.

1487-ci ildə öz xatiratını yazmışdır. Bu xatirat 1543-1545-ci illərdə oğulları tərəfindən "Venesiyadan Tana və İrana edilən səfərlər" (it. Fiaggi falti da Fenezia alla Tana in Persi) adı ilə çap olunmuşdur. İosafat Barbaro bir qayda olaraq Kontarinidən daha çox məlumat vermiş, daha araşdırmaçı olmuşdur. Onun Qıpçaq xanlığı, İran və Gürcüstan haqqında yazdıqları əvəzsiz hesab olunur.